Attendere prego...

News ASCG


Primo classificato, sezione "poster" del X Congresso dell'Associazione Campana Glaucoma

Valutazione dell'effetto protettivo di un'associazione fra citicolina ed omotaurina in modelli in vitro di degenerazione neuroretinica

 News pubblicata il 19/04/2017

Valutazione dell’effetto protettivo di un’associazione fra citicolina ed omotaurina in modelli in vitro di degenerazione neuroretinica

Sergio Davinelli, Flavia Chiosi, Ciro Costagliola, Giovanni Scapagnini
Dipartimento di Medicina e Scienze per la Salute “V. Tiberio”, Università degli Studi del Molise.
 
Background
La somministrazione di citicolina può efficientemente ridurre i segni della patologia nel glaucoma, in cui la retina è soggetta a cambiamenti neurodegenerativi. Nei pazienti con glaucoma la somministrazione, orale o intramuscolare, di citicolina è stata associata ad un miglioramento della funzione retinica e delle funzioni visive. Inoltre, in pazienti con glaucoma progressivo, la somministrazione di citicolina per via orale ha recentemente dimostrato di rallentare il tasso di progressione del danno glaucomatoso. L’omotaurina (3-amino-1-propane sulfonic acid, tramiprosato) è un composto aminosolfonato di origine naturale con effetti neuromodulatori e neuroprotettivi, che ha dimostrato significativi effetti positivi su sottopopolazioni selezionate di pazienti con malattia di Alzheimer o MCI ed in particolar modo sulla riduzione della perdita di massa cerebrale.
Materiali e Metodi
Nel presente lavoro sono stati testati in vitro gli effetti neuroprotettivi di omotaurina, di una nuova citicolina ultrapura ottenuta tramite fermentazione o di una combinazione dei due composti in condizioni sperimentali attinenti la degenerazione neuroretinica: 1) eccitotossicità mediata da glutammato, considerata di rilevanza fisiopatologica nel glaucoma 2) neurotossicità indotta da alte concentrazioni di glucosio (High Glucose (HG)-induced neurotoxicity), caratteristica della retinopatia diabetica.
Colture Retiniche
Le colture primarie di cellule retiniche sono state ottenute da embrioni di ratti Wistar al 18o giorno di gestazione, come già descritto. Dopo la separazione con tripsina le cellule retiniche sono state seminate su piastre di coltura cellulare rivestite con poli-L-lisina o coperte da vetrino e cresciute in Minimum Essential Medium (MEM)/Foetal Calf Serum (FCS) (Life Technologies, Monza, Italia), dando luogo ad una popolazione cellulare mista gliale-neuronale.
Trattamento delle colture cellulari
Abbiamo precedentemente valutato la citotossicità dei due composti su cellule retiniche a differenti concentrazioni (1, 10, 100 µM) per 24 h (fig.1). Nessuna delle concentrazioni ha indotto mortalità cellulare. Per indurre danno cellulare apoptotico eccitotossico, a 8 giorni, le colture cellulari sono state trattate con with 100 µM di glutammato per 25 minuti. Il mezzo di coltura è stato poi sostituito con MEM/FCS fresco e le cellule sono state esaminate dopo 24h (fig.2 e 3). Per ricreare le condizioni diabetiche, le colture primarie di cellule retiniche sono state trattate con High Glucose (30 mM) al giorno 6 per 96 h. La metà del mezzo di coltura cellulare è stata sostituita con HG fresco ogni 24 h per mantenere alta la concentrazione di glucosio. Le colture di controllo sono state mantenute in MEM/FCS ad una concentrazione di glucosio normale (NG, 5.5 mM). Per valutare l’attività neuroprotettiva, sono state somministrate alle colture 10 µM di citicolina, 10 µM di omotaurina o una combinazione delle due in proporzione 1:1 per una concentrazione totale di 10 µM, 24 h prima del trattamento con glutammato e 30 min prima del trattamento con HG e ogni 24 h con il mezzo HG fresco.
Saggio di sopravvivenza MTT
Il saggio di sopravvivenza MTT è stato effettuato come descritto in precedenza. MTT (3-(4,5-dimethylthiazoi-2-yl)-2,5-diphenyl tetrazolium bromide; Sigma) è stato solubilizzato in PBS a 5 mg/ml e sterilizzato attraverso il passaggio nel filtro Millipore (0.22 p.m). Questa soluzione madre è stata aggiunta al pozzetto coltura (1:9) e incubato a 37 ° C per 1 ora, le cellule vitali con mitocondri attivi, hanno determinato la rottura dell’anello tetrazolico in un prodotto di reazione visibile, cristalli di formazano blu scuro. Le cellule vitali e le cellule morte in ogni pozzetto sono state contate al microscopio in campo chiaro . In tutti i casi, la sopravvivenza percentuale determinata mediante il saggio MTT era pressoché identica ai valori determinati unicamente con la morfologia. Tutti i valori sono espressi come media ± SEM di almeno tre culture . Tutti gli esperimenti sono stati ripetuti almeno tre volte. Sono mostrati i risultati ottenuti in esperimenti rappresentativi. La significatività statistica è stata determinata con il test t di student per dati indipendenti. La significatività statistica è stata fissata a p<0,05 per tutti i valori riproducibili.   
Rilevazione dell’apoptosi
I livelli di apoptosi sono stati analizzati mediante immunolocalizzazione di oligonucleosomi rilasciati dal nucleo al citoplasma di neuroni apoptotici . È stato utilizzato il sandwich enzyme-linked immunosorbent assay (cell death detection ELISA, Roche).
Conclusioni
Considerando che l’eccitotossicità gioca un ruolo cruciale nella fisiopatologia del glaucoma, i nostri risultati suggeriscono che la combinazione di citicolina e omotaurina possiede un’ attività sinergica nel contrastare l’effetto tossico del glutammato e può contribuire al rallentamento della progressione di malattia. Inoltre, i nostri risultati mostrano che, dopo esposizione ad un mezzo di coltura cellulare ad alta concentrazione di glucosio, la combinazione di citicolina e omotaurina ha ridotto in modo sinergico l’apoptosi delle cellule retiniche, dimostrando un'efficacia promettente contro la retinopatia diabetica. La formulazione potrebbe contenere anche composti dotati di capacità attivazione del brain derived neurotrophic factor (BDNF) come l'acido docosaesaenoico (DHA), per meglio sostenere la sopravvivenza retinica in condizioni come glaucoma o diabete.



Registrati alla Newsletter

Registrati alla nostra newsletter e riceverai le ultime news direttamente nella tua casella!